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于剛主任醫(yī)師 北京兒童醫(yī)院 眼科 文章來(lái)源：中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2022,45(1):14-23.摘要感染性眼病是發(fā)展中國(guó)家重要致盲原因之一，病原微生物檢查是感染性眼病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。由于眼部組織取材困難、標(biāo)本量少，實(shí)驗(yàn)室診斷陽(yáng)性率偏低，嚴(yán)重影響疾病的診斷和預(yù)后。我國(guó)大多數(shù)醫(yī)療機(jī)構(gòu)感染性眼病實(shí)驗(yàn)室診斷能力不足，缺乏眼部微生物檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化方法。為此，北京醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)分會(huì)組織專家和相關(guān)課題組通過(guò)討論和臨床驗(yàn)證，總結(jié)出適合我國(guó)眼科臨床實(shí)踐的病原學(xué)診斷路徑，形成感染性眼病實(shí)驗(yàn)室診斷專家共識(shí)。該共識(shí)從常見(jiàn)感染性眼病臨床表現(xiàn)和送檢指征入手，規(guī)范眼部標(biāo)本采集、轉(zhuǎn)運(yùn)、質(zhì)量評(píng)估的方法和流程；強(qiáng)調(diào)眼科醫(yī)師應(yīng)與微生物檢驗(yàn)人員充分配合，正確選擇適宜的微生物檢測(cè)方法，提倡床旁接種，同時(shí)針對(duì)刮片細(xì)胞學(xué)檢查、傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)、棘阿米巴培養(yǎng)以及核酸檢測(cè)、宏基因組測(cè)序等技術(shù)提出建議。感染性眼病是由病原微生物感染眼球組織及其附屬器（結(jié)膜、角膜、前房、玻璃體、瞼緣及淚器等），導(dǎo)致局部組織損傷、功能破壞，進(jìn)而引起視力下降的一類致盲性疾病［1］。由于受衛(wèi)生條件及醫(yī)療水平的限制，這類疾病始終是中低收入國(guó)家的高發(fā)病。我國(guó)感染性角膜炎發(fā)病率為發(fā)達(dá)國(guó)家（約0.04%）的5倍，達(dá)到0.192%［1,?2,?3］；手術(shù)源性感染性眼內(nèi)炎也有上升趨勢(shì)，基層白內(nèi)障術(shù)后感染性眼內(nèi)炎發(fā)病率高達(dá)0.11%［4］，幾乎是發(fā)達(dá)國(guó)家的10倍（0.012%~0.053%）［5,?6,?7,?8］。然而，我國(guó)大多數(shù)醫(yī)療機(jī)構(gòu)感染性眼病微生物檢驗(yàn)?zāi)芰Σ蛔?，缺乏有可靠病原學(xué)證據(jù)的臨床經(jīng)驗(yàn)。2018年北京醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)分會(huì)組織有關(guān)專家就此問(wèn)題進(jìn)行專項(xiàng)討論，借鑒國(guó)內(nèi)外先進(jìn)的眼科病原學(xué)檢驗(yàn)手段，建立適應(yīng)于綜合醫(yī)院開(kāi)展該項(xiàng)工作的標(biāo)準(zhǔn)化方法。在此基礎(chǔ)上，北京醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)分會(huì)委托北京市眼科研究所及首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院開(kāi)展相關(guān)臨床驗(yàn)證工作。經(jīng)過(guò)3年努力，分析整理1256例不同類型感染性眼病診療數(shù)據(jù)后，總結(jié)出適合我國(guó)眼科病原學(xué)診斷路徑、技術(shù)手段及應(yīng)用場(chǎng)景，形成如下專家共識(shí)。一、常見(jiàn)病原體及送檢指征眼科臨床檢查及微生物實(shí)驗(yàn)室檢查是感染性眼病診斷不可缺少的2個(gè)重要組成部分，因此在實(shí)驗(yàn)室診斷過(guò)程中，檢驗(yàn)醫(yī)師需清楚地了解樣本來(lái)源及患者臨床表現(xiàn)，以便對(duì)眼各個(gè)部位可能存在的病原體及不同類型眼部感染可能相關(guān)的微生物作出初步判斷。為此，本共識(shí)首先簡(jiǎn)要介紹眼的解剖（圖1），使檢驗(yàn)醫(yī)師在了解眼解剖基礎(chǔ)上，明確取材部位及標(biāo)本來(lái)源；其次，詳細(xì)介紹常見(jiàn)感染性眼病送檢指征及具體檢查內(nèi)容（表1），建立病原學(xué)診斷路徑（圖2）。1.感染性結(jié)膜炎：結(jié)膜暴露于外界環(huán)境中容易發(fā)生感染性結(jié)膜炎，結(jié)膜充血及分泌物增多是其典型的臨床特征，多數(shù)結(jié)膜炎無(wú)需進(jìn)行微生物檢查。但對(duì)于流行性、難治性、復(fù)發(fā)性或常規(guī)治療無(wú)效的感染性結(jié)膜炎，結(jié)膜刮片、培養(yǎng)或核酸檢測(cè)對(duì)其診療具有重要意義［9］。感染性結(jié)膜炎常見(jiàn)的病原體有金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、其他α-溶血性鏈球菌、腸桿菌目、不動(dòng)桿菌屬、棒狀桿菌屬、腺病毒（兒童3、7型；成人8、11、19型）、單純皰疹病毒（1、2型）、柯薩奇病毒A24型及腸病毒70型等。A~C血清型沙眼衣原體可引起沙眼性結(jié)膜炎，D~K血清型沙眼衣原體可引起包涵體性結(jié)膜炎［10,?11］。2.感染性角膜炎：感染性角膜炎多由病原微生物侵入角膜引起，對(duì)擬診化膿性角膜炎（細(xì)菌、真菌、阿米巴感染）者需通過(guò)實(shí)驗(yàn)室檢查進(jìn)行確診［12］。而對(duì)于非化膿性（病毒性）角膜炎者，可依靠反復(fù)發(fā)作的病史及角膜病變特點(diǎn)進(jìn)行臨床診斷。由于角膜病灶取材量少，標(biāo)本應(yīng)立即進(jìn)行涂片染色鏡檢或床旁微生物接種；除常規(guī)角膜刮片和培養(yǎng)外，還可選擇進(jìn)行病原體核酸檢測(cè)。細(xì)菌性角膜炎以金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎鏈球菌、溶血性鏈球菌、銅綠假單胞菌（隱形眼鏡）及腸桿菌目細(xì)菌等感染為主［13］；非典型分枝桿菌（龜分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、膿腫分枝桿菌）較為少見(jiàn)，一般見(jiàn)于創(chuàng)傷后或屈光手術(shù)后的患者。病毒性角膜炎以單純皰疹病毒（1、2型）、水痘-帶狀皰疹病毒、柯薩奇病毒A24、腸道病毒70感染為主，另外埃博拉病毒和蟲(chóng)媒病毒感染（寨卡病毒、登革熱和基孔肯雅病毒）可引起輕度角膜炎［14］。真菌性角膜炎常發(fā)生于植物外傷或有眼表慢性疾病的患者中，常見(jiàn)的絲狀真菌有鐮刀菌、曲霉菌、絲孢菌屬、擬青霉屬、支頂孢屬和彎孢菌屬等。在免疫功能低下的患者中，可出現(xiàn)念珠菌、隱球菌引起的角膜炎［15］。寄生蟲(chóng)性角膜炎罕見(jiàn)，以棘阿米巴原蟲(chóng)感染為主，另外還有微孢子蟲(chóng)、變形蟲(chóng)及蠅蛆幼蟲(chóng)所致的角結(jié)膜炎［16］。3.感染性瞼緣炎：瞼緣出現(xiàn)如下體征之一可疑診為感染性瞼緣炎。（1）瞼緣充血、睫毛脫落，睫毛基底部見(jiàn)小膿皰、鱗屑或袖套樣物質(zhì)；（2）對(duì)于經(jīng)驗(yàn)性治療無(wú)效的前部瞼緣炎患者可進(jìn)行瞼緣分泌物培養(yǎng)［17］（需氧及厭氧培養(yǎng)同時(shí)進(jìn)行）；（3）對(duì)于瞼板腺功能障礙或眼部紅斑痤瘡患者，睫毛有袖套樣改變時(shí)，需進(jìn)行睫毛螨蟲(chóng)顯微鏡檢查，涂片和培養(yǎng)有助于發(fā)現(xiàn)病原菌。常見(jiàn)病原體有金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、痤瘡皮膚桿菌、酵母菌（皮屑芽孢菌）、毛囊蠕形螨（睫毛根部）、蠅蛆幼蟲(chóng)及陰虱等，注意區(qū)別正常菌群［18］。4.感染性淚道炎：淚液的排出系統(tǒng)稱為淚道，出現(xiàn)如下體征可擬診為淚道感染，如淚溢、內(nèi)眥部黏性分泌物，淚小點(diǎn)或淚囊處紅腫，擠壓淚小點(diǎn)或淚囊后可見(jiàn)膿性分泌物溢出。經(jīng)驗(yàn)性治療無(wú)效的淚小管炎或淚囊炎并發(fā)角結(jié)膜炎或眶蜂窩織炎患者，需進(jìn)行淚道分泌物細(xì)胞微生物學(xué)檢查［19］。常見(jiàn)病原體有放線菌科屬（放線菌屬和諾卡菌屬最常見(jiàn)）、肺炎鏈球菌、溶血性鏈球菌、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌及革蘭陰性桿菌等。淚道真菌（曲霉菌、鏈格孢霉、念珠菌、枝頂孢屬）感染較罕見(jiàn)［20］。5.感染性眼內(nèi)炎：特指微生物在眼內(nèi)引起的感染，進(jìn)展迅速，屬臨床急重癥致盲性眼病，包括眼內(nèi)炎（細(xì)菌、真菌）、病毒性眼內(nèi)炎、寄生蟲(chóng)性眼內(nèi)炎等。感染性眼內(nèi)炎常合并開(kāi)放性眼外傷、內(nèi)眼手術(shù)史、糖尿病、器官移植、長(zhǎng)期免疫抑制劑使用史。表現(xiàn)為眼紅、眼痛、流淚、視力下降，睫狀充血、房水閃輝、房水浮游細(xì)胞乃至前房積膿、瞳孔后粘連、玻璃體明顯混濁、視網(wǎng)膜前絨球樣混濁等［21］。外源性眼內(nèi)炎常見(jiàn)于術(shù)后感染和眼外傷（特別是白內(nèi)障和青光眼術(shù)后），常見(jiàn)病原體包括葡萄球菌、腸球菌、鏈球菌、腸桿菌、非發(fā)酵菌、需氧芽孢桿菌、曲霉菌、鐮刀菌、暗色真菌等，表現(xiàn)為多病原體混合感染，其中凝固酶陰性葡萄球菌易造成急性感染，痤瘡皮膚桿菌是慢性感染最常見(jiàn)原因，警惕高毒力肺炎克雷伯菌的眼內(nèi)感染，假單胞菌與絲狀真菌少見(jiàn)［22］。內(nèi)源性眼內(nèi)炎多來(lái)自血源性感染，常見(jiàn)病原體有肺炎鏈球菌、葡萄球菌、α-溶血性鏈球菌、分枝桿菌、酵母菌、絲狀真菌、腸球菌、乏養(yǎng)球菌、顆粒鏈菌、流感嗜血桿菌、韋榮球菌、普雷沃菌、念珠菌等。視網(wǎng)膜炎以病毒感染為主，包括單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、帶狀皰疹病毒、EB病毒等［23］。虹膜、睫狀體和/或脈絡(luò)膜的炎癥可與細(xì)菌來(lái)源（伯氏疏螺旋體、梅毒螺旋體、分枝桿菌、鉤端螺旋體、巴爾通體）、病毒來(lái)源（皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒）或寄生蟲(chóng)來(lái)源（弓蛔蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)、盤尾絲蟲(chóng)、囊尾蚴）的全身性或局部性感染有關(guān)。剛地弓形蟲(chóng)是脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎的元兇，是感染性后葡萄膜炎的主要原因［24］。二、標(biāo)本采集及質(zhì)量評(píng)估（一）標(biāo)本采集及轉(zhuǎn)運(yùn)原則參考2018年美國(guó)微生物實(shí)驗(yàn)室操作指南、2021年美國(guó)眼部感染臨床微生物實(shí)驗(yàn)室實(shí)用指南以及2021年歐洲微生物手冊(cè)制定如下規(guī)則［25,?26］。1.強(qiáng)調(diào)“即刻送檢、即刻涂片、床旁接種”原則，尤其需進(jìn)行厭氧培養(yǎng)的標(biāo)本；若難以實(shí)現(xiàn)即刻接種，則需室溫保存，標(biāo)注采集時(shí)間。標(biāo)本采集、儲(chǔ)存、轉(zhuǎn)運(yùn)方法見(jiàn)表2。2.用于培養(yǎng)的標(biāo)本原則上需同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞微生物學(xué)檢查；用于PCR的標(biāo)本，需避免滑石粉、熒光素鈉和眼部麻醉劑的使用。3.由于眼部標(biāo)本較為珍貴且標(biāo)本量少，醫(yī)生應(yīng)告知實(shí)驗(yàn)室具體檢測(cè)項(xiàng)目及優(yōu)先次序。4.結(jié)膜分泌物應(yīng)雙眼取材并在申請(qǐng)單注明眼別、部位，以便于結(jié)膜囊正常菌群的分析。5.角膜潰瘍標(biāo)本應(yīng)由具有臨床經(jīng)驗(yàn)的眼科醫(yī)師或眼科技師在裂隙燈顯微鏡下使用無(wú)菌刮鏟或無(wú)菌手術(shù)刀片輕柔刮取，即刻涂片并床旁接種。角膜組織和活檢標(biāo)本建議使用無(wú)菌剪刀或手術(shù)刀片切碎后再行接種；眼內(nèi)標(biāo)本（房水或玻璃體）需手術(shù)取材，使用原液進(jìn)行涂片、接種。6.眼內(nèi)液包括房水和玻璃體液，有創(chuàng)性眼內(nèi)液檢測(cè)，僅適用于高度懷疑的感染性眼內(nèi)炎患者，須由有經(jīng)驗(yàn)眼科醫(yī)師在無(wú)菌環(huán)境下采集。操作前需用抗生素（如氧氟沙星、妥布霉素）滴眼液點(diǎn)眼，表面麻醉后皮膚消毒、聚維酮碘結(jié)膜囊沖洗。房水取出量以0.05~0.1ml為宜，玻璃體灌洗液則需離心（800轉(zhuǎn)/min×10min，離心半徑10cm）后取沉淀涂片或甩片后顯微鏡檢查或微生物培養(yǎng)，也可使用0.22μm無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾，將過(guò)濾膜進(jìn)行細(xì)菌和真菌培養(yǎng)。房水或玻璃體標(biāo)本，可注入無(wú)菌EP管中進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，也可將注射器連帶針頭及針帽，置于密閉標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)箱中快速轉(zhuǎn)運(yùn)。7.隱形眼鏡或與眼外傷相關(guān)異物也可進(jìn)行微生物檢測(cè)，但其培養(yǎng)結(jié)果需根據(jù)病情謹(jǐn)慎解釋。（二）標(biāo)本質(zhì)量評(píng)估眼部標(biāo)本不建議拒收，即使標(biāo)本量少、轉(zhuǎn)運(yùn)超時(shí)，仍要盡可能完成檢驗(yàn)，及時(shí)與臨床醫(yī)生溝通，爭(zhēng)取二次送檢。標(biāo)本評(píng)估應(yīng)遵循如下原則。1.刮片標(biāo)本評(píng)估：進(jìn)行刮片細(xì)胞微生物學(xué)檢查的標(biāo)本，如分泌物、膿液或壞死組織應(yīng)制成均勻薄層涂片，直徑約10mm。除玻璃體灌洗液需離心后取沉淀或甩片外，其余均應(yīng)使用原始標(biāo)本。（1）組織標(biāo)本評(píng)估：載玻片上肉眼可見(jiàn)分泌物、膿液或壞死組織薄層平鋪，不形成組織細(xì)胞堆積。（2）角膜刮片評(píng)估：角結(jié)膜病灶及周圍脫落或炎性細(xì)胞數(shù)量須≥1級(jí)。國(guó)際上將刮片細(xì)胞數(shù)量（顯微鏡下可見(jiàn)到的所有細(xì)胞）分為4級(jí)，即以低倍鏡（LP）下細(xì)胞計(jì)數(shù)為準(zhǔn)，0級(jí)：≤10/LP，1級(jí)：11~50/LP，2級(jí)：51~100/LP，3級(jí)：101~1000/LP，4級(jí)：>1000/LP［27］。其他組織標(biāo)本（如房水和玻璃體等）也可參照此標(biāo)準(zhǔn)。2.培養(yǎng)標(biāo)本評(píng)估：包括標(biāo)本采集前是否使用抗菌藥物、抗菌藥物種類及時(shí)間；采集方式、轉(zhuǎn)運(yùn)裝置、采樣量；是否床旁接種、是否在2h內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室；申請(qǐng)檢查項(xiàng)目的適宜性等。由于不建議拒收標(biāo)本，因此對(duì)評(píng)估不合格的標(biāo)本需在結(jié)果報(bào)告中進(jìn)行描述。三、實(shí)驗(yàn)室檢查（一）刮片細(xì)胞微生物學(xué)檢查對(duì)于感染性眼病實(shí)驗(yàn)室診斷，除睫毛螨蟲(chóng)、陰虱或結(jié)膜吸吮線蟲(chóng)外，在培養(yǎng)、核酸及免疫學(xué)檢測(cè)之前均應(yīng)進(jìn)行細(xì)胞微生物學(xué)檢查，強(qiáng)調(diào)從病理學(xué)角度重視眼部刮片細(xì)胞學(xué)檢查。刮片染色方法選擇取決于臨床擬診及疑似的病原體類型。常用的染色方法包括姬姆薩染色、革蘭染色、熒光染色和抗酸染色等。常用染色方法及檢查對(duì)象見(jiàn)表3。1.姬姆薩染色：用于組織病理及病原體形態(tài)學(xué)檢查，是眼科最常用的染色方法。根據(jù)病原體形態(tài)特征及排列方式可對(duì)細(xì)菌、包涵體、真菌、阿米巴等微生物進(jìn)行鑒別，眼部常見(jiàn)病原微生物姬姆薩染色后顯微鏡下特征見(jiàn)表4。姬姆薩染色也可對(duì)病灶處的角結(jié)膜上皮細(xì)胞、炎性滲出細(xì)胞（中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、單核吞噬細(xì)胞、漿細(xì)胞及肥大細(xì)胞等）以及特殊組織細(xì)胞進(jìn)行觀察。按照炎性細(xì)胞所占比例可判斷感染還是非感染，急性感染（中性粒細(xì)胞為主）還是慢性感染（淋巴細(xì)胞增多）；同時(shí)，不同微生物感染周圍炎癥細(xì)胞類型有所差異，如棘阿米巴感染可出現(xiàn)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；衣原體感染急性期以中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主，病毒感染則以淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為主，可出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)包涵體。2.革蘭染色：鏡下描述同常規(guī)微生物檢查。根據(jù)菌體形態(tài)（桿菌、球菌、球桿菌）、染色特性（陽(yáng)性、陰性或不確定）、排列方式（成雙、成堆或散在，短鏈或長(zhǎng)鏈等）、白細(xì)胞吞噬等因素判斷。如涂片見(jiàn)到大量中性粒細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)外可見(jiàn)革蘭陽(yáng)性雙球菌、呈矛頭樣相對(duì)排列、有厚莢膜，可報(bào)告疑似肺炎鏈球菌［28］。3.熒光染色：利用熒光素標(biāo)記的幾丁質(zhì)酶可特異性結(jié)合真菌細(xì)胞壁的多糖及幾丁質(zhì)，5min內(nèi)快速判斷標(biāo)本中是否含有真菌成分。組織背景為均質(zhì)黑色或弱藍(lán)色熒光，真菌細(xì)胞壁則呈亮藍(lán)紫色或明亮熒光藍(lán)，容易識(shí)別菌絲或孢子形態(tài)、結(jié)構(gòu)、菌絲密度等［29］。因棘阿米巴包囊同樣含幾丁質(zhì)成分，包囊也可呈淡染的藍(lán)綠色。熒光染色可顯著提高對(duì)真菌、微孢子蟲(chóng)和棘阿米巴診斷的敏感性，但需注意拭子棉纖維以及任何含纖維素或幾丁質(zhì)的其他物質(zhì)可能會(huì)造成假陽(yáng)性。4.抗酸染色及弱抗酸染色：抗酸染色可對(duì)眼部抗酸菌，主要包括結(jié)核分枝桿菌（M.tuberculosis，MTB）、非結(jié)核分枝桿菌（nontuberculoausmycobacteria，NTM）進(jìn)行檢測(cè)。疑似諾卡菌感染或微孢子蟲(chóng)可使用弱抗酸染色，菌體或蟲(chóng)體呈粉紅色著染為陽(yáng)性。5.濕片法：常用的方法有生理鹽水濕片法和KOH濕片法，其中生理鹽水濕片法主要用于棘阿米巴滋養(yǎng)體和包囊的活體觀察，尤其適用于觀察滋養(yǎng)體的運(yùn)動(dòng)情況。棘阿米巴滋養(yǎng)體在角膜組織間移行，呈不規(guī)則、易變化等特點(diǎn)，其胞質(zhì)內(nèi)富含顆粒物質(zhì)，可隨滋養(yǎng)體的變形而運(yùn)動(dòng)。囊前期包囊雙層囊壁尚未形成，胞質(zhì)內(nèi)含有均勻的較粗大顆粒狀物，較活躍，不停顫動(dòng)。成熟包囊具有內(nèi)外囊壁雙層結(jié)構(gòu)。空囊則呈皺縮狀、無(wú)內(nèi)容物，常見(jiàn)于抗阿米巴治療后。KOH濕片法也可用于絲狀真菌的觀察，將采集的標(biāo)本混勻涂于滴有10%~20%KOH溶液的清潔載玻片上，加蓋玻片，過(guò)酒精燈火焰2~3次，冷卻后低倍鏡觀察。KOH可消化組織細(xì)胞，使真菌菌絲清晰可見(jiàn)。6.寄生蟲(chóng)檢查：除棘阿米巴原蟲(chóng)外，常見(jiàn)眼部寄生蟲(chóng)還包括結(jié)膜吸吮線蟲(chóng)、睫毛的螨蟲(chóng)及陰虱。結(jié)膜吸吮線蟲(chóng)生長(zhǎng)于結(jié)膜囊內(nèi)，裂隙燈下可見(jiàn)白色線頭樣蟲(chóng)體蠕動(dòng)，鑷子取出光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。螨蟲(chóng)位于睫毛毛囊內(nèi)，光學(xué)顯微鏡下（100倍）尋找蠕形螨成蟲(chóng)、幼蟲(chóng)或蟲(chóng)卵。陰虱常生長(zhǎng)于睫毛毛根及毛干，裂隙燈下剪除或拔取睫毛后光學(xué)顯微鏡下觀察成蟲(chóng)及蟲(chóng)卵，容易診斷。（二）傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)1.培養(yǎng)基：眼部微生物常規(guī)培養(yǎng)包括需氧、兼性厭氧、厭氧及真菌培養(yǎng)等，必要時(shí)可增加微需氧及分枝桿菌培養(yǎng)。常用培養(yǎng)基包括哥倫比亞血瓊脂、巧克力瓊脂，必要時(shí)增加麥康凱、沙保羅、馬鈴薯及厭氧血瓊脂培養(yǎng)基。強(qiáng)調(diào)厭氧培養(yǎng)的重要性，同時(shí)眼微生物醫(yī)/技師需與臨床醫(yī)師密切溝通，對(duì)來(lái)之不易的標(biāo)本盡可能全面進(jìn)行有助于診斷的檢驗(yàn)項(xiàng)目。2.培養(yǎng)條件：生化培養(yǎng)箱適用于不同溫度下生長(zhǎng)的細(xì)菌及真菌的培養(yǎng)，一般情況下，細(xì)菌培養(yǎng)溫度34~36℃，2~5d；真菌培養(yǎng)溫度27~29℃或34~36℃，7~30d。細(xì)菌培養(yǎng)的環(huán)境包括需氧、厭氧（厭氧袋、厭氧罐及厭氧手套箱），5%~7%CO2培養(yǎng)箱，微需氧等；除常規(guī)哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)3~5d外，分枝桿菌的生長(zhǎng)需要羅氏或米氏7H10培養(yǎng)基以及BACTECMGIT培養(yǎng)系統(tǒng)，7d后觀察生長(zhǎng)情況，培養(yǎng)最長(zhǎng)需56d。眼部真菌適合馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或沙氏培養(yǎng)基斜面，每日觀察，刮片/涂片呈陽(yáng)性但培養(yǎng)為陰性、懷疑罕見(jiàn)或生長(zhǎng)緩慢真菌應(yīng)延長(zhǎng)觀察期至4~8周。3.關(guān)于增菌：眼部感染標(biāo)本不建議增菌，尤其來(lái)自與外界相通部位分泌物，如結(jié)膜、淚道、淚囊。術(shù)中取材的房水、玻璃體液及角膜等可進(jìn)行增菌。4.微生物鑒定：基于菌落的生化試驗(yàn)、自動(dòng)化儀器及MALDI-TOF質(zhì)譜是目前常用的鑒定手段，后者無(wú)論針對(duì)細(xì)菌還是真菌均可實(shí)現(xiàn)快速鑒定。必要時(shí)可選用rDNA（16S、18S或28S）及ITS/D1D2測(cè)序技術(shù)進(jìn)行鑒定。5.抗菌藥物敏感實(shí)驗(yàn)：國(guó)內(nèi)基本選擇臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（clinicalandlaboratorystandardsinstitute，CLSI）標(biāo)準(zhǔn)［30］，但眼科多局部用藥，其局部暴露劑量遠(yuǎn)高于血清藥物濃度，抗菌藥物敏感實(shí)驗(yàn)（antimicrobialsusceptibilitytesting，AST）結(jié)果僅供參考。對(duì)外眼標(biāo)本，有時(shí)無(wú)法鑒別分離菌株為共生菌群、污染或感染真正病原體，除凝固酶陰性的葡萄球菌（非路鄧葡萄球菌）和類白喉棒狀桿菌外，對(duì)單一微生物純培養(yǎng)或培養(yǎng)出2種優(yōu)勢(shì)病原體，需行鑒定和AST（金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌無(wú)論菌落多少，均應(yīng)行鑒定和AST）。相較之下，內(nèi)眼標(biāo)本應(yīng)作為無(wú)菌部位處理，任何培養(yǎng)陽(yáng)性病原體皆需鑒定和AST。如果CLSI缺少某種抗菌藥物的判定標(biāo)準(zhǔn)，可參考本地流行病學(xué)結(jié)果用藥。（三）棘阿米巴培養(yǎng)及鑒定棘阿米巴性角膜炎多由棘阿米巴原蟲(chóng)感染所致，偶有耐格里屬感染的報(bào)道。角膜棘阿米巴原蟲(chóng)的培養(yǎng)常規(guī)選擇Page非營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，其固體培養(yǎng)基可在100ml液體培養(yǎng)基中加入1.5g瓊脂。在使用Page非營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基前，應(yīng)在其瓊脂表面涂布活的或滅活的大腸埃希菌菌液，標(biāo)本點(diǎn)種于瓊脂中心，置于濕盒內(nèi)28℃孵育，每天觀察，至少觀察至第10d。棘阿米巴可自瓊脂表面接種部位生長(zhǎng)并向四周移行，產(chǎn)生不規(guī)則軌跡，培養(yǎng)1d即可在顯微鏡下觀察到，接種5~10d后可通過(guò)肉眼觀察發(fā)現(xiàn)瓊脂表面出現(xiàn)菲薄波紋狀改變，低倍鏡下見(jiàn)到小圓形或多邊形壁厚包囊，折光性強(qiáng)；滋養(yǎng)體呈圓形、橢圓形、不規(guī)則等形態(tài)，并向四周移行覓食，所以接種部位的遠(yuǎn)端則以滋養(yǎng)體居多。用小刀片切取一片表面瓊脂，在顯微鏡的油鏡下觀察，可清晰分辨出棘阿米巴滋養(yǎng)體和包囊的形態(tài)、結(jié)構(gòu)。因抗阿米巴藥物有限，臨床上無(wú)需常規(guī)開(kāi)展抗棘阿米巴藥物敏感試驗(yàn)，在新藥研發(fā)時(shí)可采用微量稀釋法。（四）核酸檢測(cè)目前尚無(wú)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的眼部標(biāo)本核酸擴(kuò)增檢測(cè)試劑，大部分核酸檢測(cè)采用實(shí)驗(yàn)室自行建立的方法，對(duì)常規(guī)培養(yǎng)陰性的標(biāo)本，核酸檢測(cè)成為診斷病毒性角膜炎、葡萄膜炎和視網(wǎng)膜炎的主要手段。利用實(shí)時(shí)定量PCR（quantitativereal-timePCR，qPCR）技術(shù)檢測(cè)腺病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒、水痘帶狀皰疹病毒、EB病毒和弓形蟲(chóng)等病原微生物已在業(yè)界達(dá)成共識(shí)［31,?32］。該方法特異度和敏感度較高［33］，可通過(guò)拷貝數(shù)評(píng)估感染現(xiàn)狀和治療效果，其陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值優(yōu)于傳統(tǒng)微生物檢測(cè)方法［34］。qPCR技術(shù)適用于急性感染期，恢復(fù)期或一過(guò)性感染，可出現(xiàn)假陰性結(jié)果［35］。此外，可利用16SrDNA和18SrDNA測(cè)序技術(shù)提高檢出率。2017年，熒光原位雜交技術(shù)（flourescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH）首次用于眼科，利用葡萄球菌特異性分子肽核酸（peptidenucleicacid，PNA）探針進(jìn)行肽核酸熒光原位雜交（PNA-FISH），20min即可實(shí)現(xiàn)眼內(nèi)液病原體檢測(cè)［36］。近期，有研究擴(kuò)大了FISH與PNA探針的應(yīng)用范圍，可快速檢測(cè)眼內(nèi)炎或角膜炎的常見(jiàn)細(xì)菌和真菌病原體（敏感度97%、特異度100%）［37］。對(duì)核酸檢測(cè)標(biāo)本，無(wú)菌取材后，應(yīng)立即放置于封閉的滅菌容器中（如耐低溫的凍存離心管）。對(duì)于需檢測(cè)RNA的標(biāo)本，應(yīng)放置于冰盒內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室，48h內(nèi)完成RNA的提??；需檢測(cè)DNA的標(biāo)本，可常溫保存，但不能超過(guò)72h，否則需-20℃或-80℃低溫保存；另外避免標(biāo)本反復(fù)凍融對(duì)蛋白樣品的破壞。對(duì)于眼部無(wú)菌標(biāo)本，常規(guī)檢驗(yàn)無(wú)法滿足實(shí)驗(yàn)室診斷時(shí)，可選擇宏基因組下一代測(cè)序技術(shù)（metagenomicsnextgenerationsequencing，mNGS）。該技術(shù)的無(wú)偏倚性使其成為未知病原體識(shí)別的重要手段［38］。有研究表明mNGS診斷眼內(nèi)炎的敏感度為88%，在鑒定未知低豐度微生物時(shí)，mNGS靈敏度優(yōu)于其他方法［39］。但mNGS受標(biāo)本量、標(biāo)本處理、核酸提取、文庫(kù)制備及測(cè)序深度的影響，結(jié)果的準(zhǔn)確性和特異度有待臨床進(jìn)一步驗(yàn)證。非無(wú)菌部位眼科標(biāo)本可檢測(cè)出多種微生物，臨床上難以判斷其是否致病。盡管mNGS存在局限性，但目前仍是眼科難培養(yǎng)病原體的檢測(cè)手段之一。（五）免疫學(xué)檢測(cè)繼發(fā)于全身感染的視網(wǎng)膜炎或葡萄膜炎患者可進(jìn)行血清學(xué)檢查，如梅毒螺旋體、剛地弓形蟲(chóng)和伯氏疏螺旋體等的診斷。血清、房水、玻璃體液及淚囊分泌物均可進(jìn)行病原體（包括皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、弓形蟲(chóng)、梅毒）特異性抗體和總IgG檢測(cè)，方法包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）、免疫熒光法（immunofluorescenceassay，IFA）及免疫印跡法（immunoblottingtest，IBT）等。標(biāo)本采集時(shí)機(jī)對(duì)結(jié)果解釋非常重要，當(dāng)IgG抗體恢復(fù)期較初期增高4倍或顯著增高，且急性期顯著增高可判斷為陽(yáng)性。有文獻(xiàn)報(bào)道初次感染弓形蟲(chóng)后，IgM和IgA在感染后7~14d達(dá)高峰，IgG在感染14~21d開(kāi)始上升并持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間。IgM陽(yáng)性對(duì)早期感染的診斷具有一定意義，IgG恢復(fù)期4倍高于急性期有回顧性診斷意義。通過(guò)計(jì)算Goldmann-Witmer（GW）系數(shù)，可輔助判斷眼內(nèi)該特異抗體是眼內(nèi)原位產(chǎn)生，還是因?yàn)檠鍧B漏出現(xiàn)的假陽(yáng)性。系數(shù)≥4表示局部抗體的產(chǎn)生，系數(shù)<2表示局部抗體的缺失，2~3取決于臨床情況［27］。另外，抗體的檢測(cè)與患者的免疫狀態(tài)有關(guān)，免疫功能正常者若血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果陰性可排除感染；而免疫功能低下者，其抗體合成能力有限，出現(xiàn)假陰性需謹(jǐn)慎解釋免疫學(xué)結(jié)果?？贵w的產(chǎn)生還與自身抗體、補(bǔ)體及免疫抑制劑使用有關(guān)，因此結(jié)果解釋必須結(jié)合臨床。多項(xiàng)研究證實(shí)，聯(lián)合應(yīng)用GW系數(shù)、免疫印跡法和PCR，診斷的特異度高于99%。四、報(bào)告要求眼科微生物檢測(cè)報(bào)告包括標(biāo)本信息、標(biāo)本處理方法、質(zhì)量評(píng)估及微生物檢驗(yàn)（顯微鏡檢查、微生物培養(yǎng)、鑒定和藥敏實(shí)驗(yàn)）結(jié)果?；谥腥A醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)分會(huì)2017年制定的細(xì)菌與真菌涂片鏡檢和培養(yǎng)結(jié)果報(bào)告規(guī)范專家共識(shí)（簡(jiǎn)稱2017細(xì)菌真菌報(bào)告共識(shí)）［40］，結(jié)合本共識(shí)提出如下眼科微生物檢驗(yàn)報(bào)告要求。（一）標(biāo)本信息及處理方法常見(jiàn)感染性眼病標(biāo)本類型包括結(jié)膜囊分泌物、角膜病灶刮取物、瞼緣或淚道分泌物、前房房水、玻璃體等，送檢標(biāo)本時(shí)須準(zhǔn)確標(biāo)注取材部位及取材方式，如術(shù)中取材、床旁接種、拭子轉(zhuǎn)運(yùn)、送檢時(shí)間等，同時(shí)需注明標(biāo)本處理方法，如離心沉淀、甩片、研磨等，以及涂片染色和培養(yǎng)方法。（二）標(biāo)本質(zhì)量評(píng)估結(jié)果按照前述方法進(jìn)行。注明標(biāo)本是否合格，不合格標(biāo)本須注明原因。目前國(guó)際上沒(méi)有房水和玻璃體標(biāo)本的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，可按照角結(jié)膜標(biāo)本的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。由于取材不易，即使標(biāo)本量少也不推薦拒收，可在報(bào)告單上注明其對(duì)結(jié)果可能產(chǎn)生的影響。（三）顯微鏡檢查報(bào)告1.微生物學(xué)報(bào)告：若涂片未發(fā)現(xiàn)微生物，則報(bào)告：某種染色未見(jiàn)細(xì)菌、真菌及寄生蟲(chóng)；如果陽(yáng)性，則報(bào)告：某種染色可見(jiàn)細(xì)菌或真菌或寄生蟲(chóng)，描述菌體特征、數(shù)量及周圍細(xì)胞學(xué)變化，并進(jìn)行初步診斷。（1）細(xì)菌特征描述應(yīng)包括染色后菌體形態(tài)（桿菌、球菌、球桿菌）、染色特征（陽(yáng)性、陰性或不確定）、排列方式（雙球菌、葡萄狀、四聯(lián)等）。菌體數(shù)量建議使用2017細(xì)菌真菌報(bào)告共識(shí)中半定量的報(bào)告方式，即油鏡（×1000）觀察，每視野≤1個(gè)細(xì)菌，記為+；1~5個(gè)細(xì)菌，記為++；6~30個(gè)細(xì)菌，記為+++；>30個(gè)細(xì)菌，記為++++［40］。給出初步疑似病原菌。（2）真菌應(yīng)分別敘述孢子和菌絲的形態(tài)、位置、大小、排列以及著色性等，菌絲要區(qū)別真假菌絲。對(duì)形態(tài)特征典型的菌絲和孢子，可報(bào)告疑似微生物；如發(fā)現(xiàn)酵母樣孢子和假菌絲，可報(bào)告查到酵母樣真菌孢子及假菌絲；姬姆薩染色發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)絲狀菌絲、有隔，分枝呈45°，可報(bào)告查到真菌菌絲，有隔、45°分枝，疑似曲霉菌等。（3）通過(guò)姬姆薩染色或生理鹽水濕片可觀察棘阿米巴原蟲(chóng)的滋養(yǎng)體、包囊前期、包囊及空囊4個(gè)階段，在報(bào)告中應(yīng)詳細(xì)描述原蟲(chóng)的形態(tài)特征，參考細(xì)胞計(jì)數(shù)方法描述原蟲(chóng)的數(shù)量。對(duì)螨蟲(chóng)，可報(bào)告多少只（數(shù)量）成蟲(chóng)、幼蟲(chóng)、蟲(chóng)卵/高倍視野。其他寄生蟲(chóng)可進(jìn)行蟲(chóng)體描述，給出初步診斷。2.細(xì)胞分類：除描述微生物特征外，還應(yīng)報(bào)告細(xì)胞分類，如角結(jié)膜上皮細(xì)胞、色素上皮細(xì)胞、炎性滲出細(xì)胞（中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、單核吞噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞等）及特殊的組織細(xì)胞等。同時(shí)還應(yīng)報(bào)告炎性細(xì)胞與病原體之間的關(guān)系。建議圖文報(bào)告，給出初步擬診。3.細(xì)胞計(jì)數(shù)：每油鏡視野下，≤1個(gè)細(xì)胞，記為+；每1~5個(gè)細(xì)胞，記為++；6~30個(gè)細(xì)胞，記為+++；>30個(gè)細(xì)胞，記為++++［40］。4.顯微鏡檢查結(jié)果報(bào)告：建議進(jìn)行快速報(bào)告模式，一般報(bào)告建議在2h內(nèi)發(fā)出，復(fù)雜報(bào)告不應(yīng)超過(guò)4h發(fā)出。對(duì)重要病原（如疑似蠟樣芽孢桿菌或鐮刀菌等），報(bào)告建議走危急值。（四）培養(yǎng)及藥敏報(bào)告1.培養(yǎng)陽(yáng)性的報(bào)告：對(duì)培養(yǎng)陽(yáng)性的標(biāo)本，需參照標(biāo)本來(lái)源進(jìn)一步確定是否為致病微生物。結(jié)膜、瞼緣等部位有正常菌群定植，免疫力低下時(shí)定植菌也可導(dǎo)致感染；角膜、房水及玻璃體等部位通常無(wú)菌，分離到的任何微生物應(yīng)考慮病原體感染的可能［41］。此外，看到革蘭陽(yáng)性粗大桿菌應(yīng)及時(shí)（2h內(nèi)）給出報(bào)告，提示臨床（用藥應(yīng)覆蓋蠟樣芽孢桿菌）。最后培養(yǎng)結(jié)果需結(jié)合標(biāo)本質(zhì)量、鏡檢和臨床擬診進(jìn)行綜合判斷。2.培養(yǎng)陰性的報(bào)告：對(duì)于培養(yǎng)陰性的標(biāo)本，無(wú)論是有菌部位還是無(wú)菌部位均應(yīng)報(bào)告“經(jīng)多少天某種方法培養(yǎng)，無(wú)菌生長(zhǎng)”。如果報(bào)告發(fā)出后培養(yǎng)仍在繼續(xù)，則在報(bào)告單上寫(xiě)明“培養(yǎng)將繼續(xù)進(jìn)行多少天，此報(bào)告為初級(jí)報(bào)告，最終結(jié)果多少天后查詢”。3.疑似污染的報(bào)告：對(duì)疑似污染的分離株，應(yīng)認(rèn)真查找污染來(lái)源，如果最后確定為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)污染菌，結(jié)果不應(yīng)回報(bào)臨床；如果該菌為實(shí)驗(yàn)室外污染菌，又難以確定污染來(lái)源，則需與臨床醫(yī)生進(jìn)行溝通，如實(shí)填寫(xiě)“經(jīng)多少天某種培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)某種菌生長(zhǎng)，因無(wú)法區(qū)分污染和感染，建議二次送檢”。4.混合感染的報(bào)告：對(duì)于混合感染（即分離到2種及以上微生物），可能涉及細(xì)菌、真菌及寄生蟲(chóng)（如阿米巴）多重感染，尤其淚器感染常有多種細(xì)菌共存?；旌细腥緢?bào)告的出具應(yīng)根據(jù)標(biāo)本特征、結(jié)合臨床綜合判斷。5.藥敏報(bào)告：眼部細(xì)菌藥敏報(bào)告需注明各類抗菌藥物對(duì)待測(cè)菌種的藥敏判定標(biāo)準(zhǔn)（即折點(diǎn)），如缺乏折點(diǎn)或借用其他菌種、文獻(xiàn)的折點(diǎn)，應(yīng)備注說(shuō)明。同時(shí)在報(bào)告中還應(yīng)給出本實(shí)驗(yàn)室所用標(biāo)準(zhǔn)的版本號(hào)和出版時(shí)間。眼部細(xì)菌藥敏實(shí)驗(yàn)包括MIC法和紙片擴(kuò)散法，因此藥敏報(bào)告應(yīng)給出MIC的數(shù)值或抑菌圈直徑，同時(shí)根據(jù)折點(diǎn)進(jìn)行結(jié)果解釋。（五）其他免疫學(xué)檢查多為定性試驗(yàn)，需注明方法學(xué)類型。特異性核酸擴(kuò)增有qPCR和定性PCR，按說(shuō)明書(shū)要求報(bào)告。mNGS對(duì)常規(guī)檢查陰性的病原微生物有診斷價(jià)值，條件致病菌應(yīng)在微生物專家指導(dǎo)下解讀。五、小結(jié)眼科醫(yī)生在申請(qǐng)檢查項(xiàng)目前應(yīng)全面評(píng)估眼部病變情況，根據(jù)臨床擬診選擇染色及培養(yǎng)方法。如果出現(xiàn)刮/涂片結(jié)果與培養(yǎng)不一致時(shí)，實(shí)驗(yàn)室人員應(yīng)及時(shí)與臨床醫(yī)生溝通。如果膿性標(biāo)本培養(yǎng)陰性應(yīng)考慮多種因素影響，如取材、轉(zhuǎn)運(yùn)方式、轉(zhuǎn)運(yùn)周期、抗生素使用、麻醉劑的影響、特殊病原體等。在此，強(qiáng)調(diào)眼科醫(yī)師應(yīng)與微生物檢驗(yàn)人員充分配合，正確采集標(biāo)本，提倡床旁接種。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立滿足眼科病原體檢驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)，除傳統(tǒng)培養(yǎng)外應(yīng)具備核酸、抗體和特殊染色的檢測(cè)方法，補(bǔ)充病毒、非典型病原體及寄生蟲(chóng)等檢查內(nèi)容。常用抗菌藥物敏感試驗(yàn)折點(diǎn)并不適合眼科局部用藥，多數(shù)情況仍需依靠醫(yī)生經(jīng)驗(yàn)或結(jié)合當(dāng)?shù)亓餍胁W(xué)數(shù)據(jù)。2022年08月15日
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