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耿鑫副主任醫(yī)師 昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 神經外科 自從PCR技術被浪出來：PCR傳奇史：“浪”出來的生物技術，經歷了飛速的發(fā)展和技術更新，新冠的洗禮，讓所有人都了解到了“核酸檢測”的技術。然而，對于初學者來說，PCR技術的名稱和原理往往令人感到困惑，傻傻分不清。某個小伙伴嘗試給讓你搞懂PCR、qPCR、dPCR、RT-PCR、RT-qPCR、Real-TimePCR之間的區(qū)別和聯(lián)系。如果你已經完全分清了，建議繼續(xù)：多重PCR——病原體檢測體系設計原則1.普通PCR(就是只做核酸的擴增哦?。?！)聚合酶鏈反應（PolymeraseChainReaction，PCR），即一代PCR，是1985年由美國PE-Cetus公司的科學家KaryBanksMulis發(fā)明的一種可在體外快速擴增特定基因或DNA序列的技術。其原理類似于DNA的天然復制過程，在體外條件下以指數(shù)級速度擴增，并通過瓊脂糖凝膠電泳對產物進行定性分析。PCR由變性（Denaturation）、退火（Annealing）和延伸（Extension）三個基本反應步驟構成：①變性：通過加熱使模板DNA的雙鏈之間的氫鍵斷裂，雙鏈分開而成為單鏈。這一步驟通常在94℃至95℃的高溫下進行，持續(xù)30秒至1分鐘，確保雙鏈DNA完全解離。②退火（復性）：當溫度降低時，引物與模板DNA中互補的區(qū)域結合成雜交分子。退火溫度通常低于引物本身的變性溫度，一般在50℃至65℃之間，持續(xù)30秒至1分鐘，確保引物與模板DNA特異性結合。；③延伸（Extension）：在DNA聚合酶、dNTPs（四種脫氧核糖核苷三磷酸）和Mg2+等存在下，DNA聚合酶催化引物按照5′→3′方向延伸，合成出與模板DNA鏈互補的DNA子鏈。延伸溫度通常在70℃至75℃之間，持續(xù)時間根據(jù)DNA聚合酶的延伸速度和目的擴增片段的長度而定。圖1?PCR的基本反應原理如果想用于核酸的檢測，其實還需要進行凝膠電泳的輔助。所以很多人認為的第一代PCR，其實更應該像是凝膠電泳技術，而不是PCR技術本身?。?！經過演化和革新，PCR技術已經發(fā)展了三代：普通PCR技術（PCR+凝膠電泳）、實時熒光定量PCR技術（qPCR）以及數(shù)字PCR（dPCR）技術。第一代PCR主要缺點：容易發(fā)生非特異性擴增和假陽性結果；檢測耗時長，操作繁瑣；只能做定性檢測。目前，在臨床檢測中普通PCR已經成為測序等檢測技術的前處理方法，沒有太多的獨立應用空間。在食品藥品等檢測和分型中，還是不少國家標準的檢測技術（畢竟標準的變革不宜那么頻繁?。?！要加把勁了，跟上新技術。）2.實時熒光定量PCR（QuantitativeReal-timePCR,qPCR）實時熒光定量PCR，也叫Real-TimePCR，即二代PCR，是指在PCR擴增反應體系中加入熒光染料或者熒光基團，在整個PCR過程中通過收集熒光信號實時監(jiān)測每一個循環(huán)中擴增產物量的變化，最后通過標準曲線和CT值對待測樣品進行定量分析。qPCR常用的有兩種方法：SYBRGreen法和TaqMan探針法。①熒光染料法（SYBRGreen）：SYBRGreenⅠ是熒光定量PCR中最常用的熒光染料，它能與所有的雙鏈DNA結合。在PCR反應體系中，加入SYBRGreenⅠ，它就會在過程中與雙鏈DNA結合，從而產生熒光信號。因此，反應中發(fā)出的全部熒光信號就會與反應中雙鏈DNA的量呈正比，熒光強度也會隨著產物的增加而增加。但是由于染料與雙鏈DNA是非特異性結合，如果反應體系中有非特異性擴增或引物二聚體的產生，也將同時被檢測，從而可能導致檢測結果不準確，因此可能產生假陽性的結果。優(yōu)點：價格相對較低；使用方便；檢測靈敏度高。缺點：檢測特異性較低，可能產生假陽性結果；無法進行多重PCR檢測。圖2熒光染料法的工作原理②熒光探針法（TaqMan技術）：TaqMan探針是最早用于定量的方法，也是臨床檢測中最常用的檢測方法。PCR擴增時，加入一對引物的同時再加入一個特異性的熒光探針。該探針是一個寡核苷酸，5'端標記一個熒光報告基團（Reporter,R），3'端標記一個淬滅基團（Quencher,Q）。當探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收，以至于無法檢測到熒光信號；而當PCR擴增時（在延伸階段），探針會被Taq酶的5'→3'外切酶活性酶切降解，使報告基團和淬滅基團分離，報告基團發(fā)射底的熒光不會再被吸收，從而可以在熒光監(jiān)測系統(tǒng)接收到熒光信號，即每擴增一條DNA，就形成一個熒光分子，PCR產物的形成與熒光分子的形成完全同步，PCR產物越多，熒光信號累積的越多，熒光強度越大。優(yōu)點：檢測特異性強；靈敏度高；適合進行多重qPCR檢測。缺點：需要根據(jù)不同的模板序列，合成不同的探針；靶序列濃度極低或存在大量非特異性擴增時，無法準確定量。圖3熒光探針法的工作原理3.逆轉錄PCR（ReverseTranscription-PCR,RT-PCR）逆轉錄PCR也叫反轉錄PCR，將RNA的反轉錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增相結合，是PCR的一種廣泛應用的變形。在RT-PCR中首先經反轉錄酶將一條單鏈RNA逆轉錄成cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的片段。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉錄的RNA產物。無論使用何種RNA，關鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組DNA的污染。RT-PCR技術靈敏且應用廣泛，可用于檢測細胞中基因表達水平，細胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。一般通過一步法或兩步法進行，一步法是RT反應和PCR反應在同一試管中進行；而在兩步法中兩個反應是分開依次進行的。4.實時熒光定量逆轉錄PCR（Real-timeRT-PCR,RT-qPCR）Real-timeRT-PCR是qPCR和RT-PCR的組合，其中的“RT”是Reversetranscription（逆轉錄）的意思，所以RT-qPCR就是結合了熒光定量技術的逆轉錄PCR，即以mRNA或總RNA為模板，先反轉錄得到cDNA，再以cDNA為模板，通過熒光定量PCR進行定量檢測分析。因為RT-PCR只可以定性，但不能進行定量分析。與RT-PCR一樣，RT-qPCR定量分析RNA也有兩種方法：一步法和兩步法。兩種方法都需要先將RNA反轉錄為cDNA，然后再將其作為qPCR擴增的模板，只是一步法中的RT和qPCR在同一試管中進行，兩步法中的RT和qPCR是按順序分開進行。?圖4RT-qPCR的一步法和兩步法5.數(shù)字PCR（DigitalPCR,Dig-PCR,dPCR）數(shù)字PCR被稱為第三代PCR技術，它是一種核酸分子絕對定量（直接定量更準確一些?。。┘夹g。相較于qPCR，數(shù)字PCR可讓你能夠直接數(shù)出DNA分子的個數(shù)，是對起始樣品的絕對定量，可針對核酸分子做更精確的定量分析。其創(chuàng)新之處在于，PCR反應體系經過微滴制備可將目標分子DNA或RNA樣品分割至數(shù)千到數(shù)萬個獨立的反應單元中，然后對眾多微反應單元內的靶序列進行單分子模板PCR擴增，實現(xiàn)”單分子模板PCR擴增”。擴增結束后含有目標分子模板的單元會發(fā)出熒光信號，最終根據(jù)泊松分布原理以及陽性微滴的比例，分析軟件可計算給出目的分子的濃度或拷貝數(shù)。目前的數(shù)字PCR技術在病原體篩查、NIPT檢測、腫瘤突變檢測等方向已得到廣泛應用。相較于第一代普通PCR和第二代qPCR，數(shù)字PCR具有以下優(yōu)勢：優(yōu)點：無需標準曲線即可對目標分子進行絕對（凡事無絕對，直接更準確）定量；測試結果可直接給出樣本具體的濃度/拷貝數(shù)，而非CT值；（抑制劑）耐受性強，通過把模板分散到各個反應微單元，能夠有效降低抑制劑對擴增的影響，可以實現(xiàn)單分子PCR擴增，非常利于復雜樣本和突變樣本的檢測，具有比傳統(tǒng)熒光定量PCR更加出色的靈敏度和精確性；可通過熒光編解碼實現(xiàn)多重/超多重PCR檢測。有個超多重數(shù)字PCR培訓班干貨滿滿，可以去蹭課哦！鏈接：超多重數(shù)字PCR黃埔軍校缺點：需要根據(jù)不同的模板序列，合成不同的探針；成本相對較高。圖4dPCR的工作原理綜上所述，PCR技術被浪出來之后，經歷了凝膠電泳技術，實時熒光定量PCR（qPCR）技術和數(shù)字PCR（dPCR）技術，其中實時熒光定量PCR技術已經發(fā)展相對成熟，數(shù)字PCR技術還在不斷地發(fā)展中。當然，除了上述名詞之外，還有不對稱PCR，TouchdownPCR，ARMSPCR，巢氏PCR等諸多概念，想要了解地更清楚，不想做幕后的小白一樣傻傻的分不清，還需要不斷地學習才行。古德拜！2024年09月24日
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賈鈺華主任醫(yī)師 南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院 中醫(yī)內科 1.新冠核酸檢測陰性，說明新冠病毒已被清除。抗體檢查則能讓你知道身體產生了多少對應抗體，明確身體抗新冠病毒感染的能力水平。從免疫角度來講，病毒進入機體引起免疫反應產生抗原、抗體。新冠病毒抗體是感染新冠病毒后機體自我產生的免疫反應標志性物質，常見的有IgM（早期急性感染的抗體）和IgG（感染時間較長后產生的抗體，可判斷既往是否發(fā)生感染）。?2.那么如何看懂新冠病毒抗體檢測報告？如果檢測完成后，一定要請專業(yè)醫(yī)生評估抗體水平。IgM和IgG的參考值范圍是0~1,0~1內屬于陰性，超過1屬于陽性。一般情況下，抗體水平越高，對感染過的病毒的免疫水平也就越高。若檢測值達到數(shù)百，就說明抗體處于較高水平。此外，兩項指標還可用作新冠病毒疫苗接種時間及接種方案的推薦依據(jù)。??3.兩項抗體指標的具體含義如下：（1）如果新冠病毒IgM抗體檢測為陽性且有相關癥狀，提示可能處于感染過程中，應當積極緩解癥狀以盡快恢復，暫不推薦接種新冠疫苗。??（2）如果新冠病毒IgG抗體陽性，IgM抗體陰性，提示既往感染過新冠病毒并基本恢復，或曾經接種過新冠疫苗。??（3）若新冠病毒IgM和IgG抗體均為陽性，提示可能正在被新冠病毒感染，但大概率已進入發(fā)病后期階段。4.??哪些人群有必要進行新冠病毒抗體檢測？新冠陽康者都可以去了解一下自己抗體水平如何，尤其是需要前往疫情高發(fā)地區(qū)或國家的人群。2023年01月22日455
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胡洋主任醫(yī)師 上海市肺科醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學科 最近各地醫(yī)院的放射科都忙得不可開交，機器不停歇，人員三班倒，做到晚上八九點，有時候還做不完，這么多工作量，大部分是檢查肺部有沒有新冠肺炎的？那檢查新冠肺炎不能做胸片嗎？輻射還少一些。做胸片當然可以，但胸片的分辨率的確低，很多人不理解胸片和CT的區(qū)別，首先大部分胸片是站著拍的，CT是躺著拍的，這個是最簡單的區(qū)別，其次胸片做出來的效果是二維圖像，人的胸廓是三位的，里面有肺有心臟有食管有氣管，有各種各樣的結構，但胸片呈現(xiàn)出來的就是一張平片，相當于把人拍扁了掛在墻上拍一張透視照，很多結構是重疊在一起的，比如心臟后面的肺組織就會被擋住，看不到。而CT則是相當于把人胸部切成幾百片，每一片都拍一張二維照片，這樣人肺的所有正常的，異常的都能看到，而且可以準確但看到病灶的大小形態(tài)，非常細膩準確。聽診是我們門診日常工作中的常規(guī)體檢項目，它的好處就是簡單易行，很容易發(fā)現(xiàn)肺部問題，但很多不發(fā)出聲音的肺部病灶是聽不出來的，容易漏診，很多新冠肺炎聽不出異常，所以還是以胸部CT檢查為主。2023年01月17日493
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胡洋主任醫(yī)師 上海市肺科醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學科 很多陽過的患者都知道，感染新冠之后可能會長期咳嗽或者咳痰，這種情況往往會令人擔心，也害怕會引起白肺，甚至想到去醫(yī)院做肺部CT，那么什么情況才需要做肺部CT呢？1、如果感染者長期發(fā)燒，溫度退不下來，持續(xù)多日，癥狀無法減輕的情況。2、目前正處于陽性階段或康復期，仍然有咳嗽、呼吸急促、呼吸困難，且呼吸頻率每分鐘大于30次。3、如果有基礎性疾病，例如支氣管炎、慢性阻塞性肺病，以及慢性心衰竭、慢性腎衰竭等情況，在感染新型冠狀病毒之后，也有必要去醫(yī)院做肺部CT檢查排除白肺。4、出現(xiàn)低氧血癥，血氧飽和度低于93%或者嘴唇以及手指末端比如指甲發(fā)黑發(fā)紫的，說明出現(xiàn)了肺受到了侵犯，要去醫(yī)院做CT排除白肺可能。最后提醒大家，感染新冠之后，自己覺得精神狀態(tài)很差，病情不見好轉的情況，應盡快就診，除了要做CT檢查外，還要密切監(jiān)測血氧飽和度。2023年01月12日1450
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彭建珩主治醫(yī)師 重醫(yī)大附一院 健康管理中心 “陽康”后的您，是否仍感到咳嗽、胸痛、乏力？是否對肺炎、心肌炎等陽后損傷心感忐忑？想清楚了解自己的身體狀況以及各項指標是否恢復正常嗎？你需要一次“陽康”后的針對性體檢。?哪些項目你必須重視起來，我這就告訴你。建議點贊收藏。?胸部CT了解新冠病毒是否對肺部造成損傷及損傷的嚴重程度，是否存在肺炎或其他異常病灶?心肌酶譜了解新冠病毒是否對心臟造成損傷及損傷程度?肝功了解新冠病毒是否侵襲重要臟器及使用藥物后是否對肝臟造成影響?腎功了解新冠病毒是否侵襲重要臟器及使用藥物后是否對腎臟造成影響?血常規(guī)是對血液細胞學的檢查，了解血象情況初步判斷是否合并細菌感染?血壓、血糖、血脂了解血糖、血壓、血脂情況，特別是患有高血壓、糖尿病、高脂血癥等基礎疾病患者的指標控制情況?心電圖了解心率、心律，新冠病毒是否對心臟造成影響?肺功能檢測了解肺部通氣和換氣功能同時，體檢前，你需要注意以下事項:?1、肝功、腎功、血糖、血脂為空腹項目，需禁食、禁飲8-12小時。?2、應衣著寬松，CT檢查時不宜佩戴項鏈及金屬制品。備孕或已孕者，請預先告知醫(yī)務人員，禁止做放射性檢查。?3、已明確患有某種疾病的人員在不影響治療的情況下前來體檢，需預先告知醫(yī)務人員。2023年01月09日1987
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宋賢亮主治醫(yī)師 亳州市人民醫(yī)院 影像中心 這一段時間做人太難了，養(yǎng)了之后怕得新冠肺炎去做CT，有了新冠肺炎怕加重，復查也要做CTCT做多了又怕輻射，你有沒有這種循環(huán)的擔心？我們今天不聊新冠，新冠聊一聊CT輻射。之前很多網友咨詢過輻射相關的話題，所以我當時用了一個很簡單的例子去解釋，一次兩次CT對我們人體幾乎沒有影響，如果影響很大的話，這種CT機器早就淘汰了。再者，我們放射工作人員每年接觸到輻射是這樣規(guī)定的，五年平均每年不超過20毫一伏，單年不超過50毫一幅。這是什么概念呢？我們以胸部CT為例，像我們醫(yī)院CT機器基本上都是西門子的，一個普通的胸部CT一般的劑量大概是三到四個好幾伏，甚至更低。 第劑量的話大概是兩毫一伏左右，甚至更低，我們以放射工作人員單年不超過50毫系服來計算，普通的人員的上限要高于這一個。同時按照一個胸部CT最大的劑量五毫一服來計算，也就是說一年我們要做十次胸部CT才能夠達到這個上限。但是一般情況下很少有人一年去做十次胸部CT的，是不是只要不超過這個安全基調，我們就可以隨便做，只要不超過十次，當然不是了，我們接受輻射是存在一些風險的，接觸越多，這種風險相對來說就越大，所以盡量的不要做一些沒有必要的檢查，不能2023年01月09日100
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崔慶宏主治醫(yī)師 北京協(xié)和醫(yī)院 急診科 新冠感染一個重要的可能危及生命的表現(xiàn)便是病毒性肺炎，在胸部CT上呈現(xiàn)多發(fā)磨玻璃改變，嚴重時雙肺大面積發(fā)白，俗稱“白肺”?！鞍追巍蓖ǔＲ馕吨∽儑乐?，會出現(xiàn)缺氧，缺氧程度重時便是呼吸衰竭，危及生命?！鞍追巍钡目植澜涍^媒體的渲染傳播使得大眾對于“白肺”可謂是聞之色變，一些但凡有些憋氣胸悶癥狀的患者就會擔心自己是不是也有了“白肺”，有時候會到醫(yī)院要求做胸部CT以確診。新冠感染后是否需要到醫(yī)院查胸部CT明確是否有“白肺”呢？“白肺”對人體最危險的影響是缺氧，評價是否缺氧有多種辦法，最為便捷可行的方法是用指氧儀測量手指的脈氧飽和度。對于無疾病的正常人來說指氧應該達到94%以上，但也有可能會偶有短時間非持續(xù)性低于94%，這種情況也未必是有異常，要結合是否有胸悶憋氣癥狀以及大部分時間指氧水平是否在94%以上。為何以94%為界？是因為這個氧飽和度所對應的血液中的氧分壓處于一個會明顯缺氧變化的界值水平，低于94%意味著存在明顯缺氧，而高于94%則通常不缺氧，這里不作更細致闡述，大家有個感性認識就好。需要注意的是，以94%為界值評估是否缺氧針對的是沒有特殊肺部疾病的患者，如果一些患者存在二氧化碳潴留性疾病如慢性阻塞性肺疾病，平時指氧水平就偏低，這種情況不宜以94%為界值以及目標，應當相應下調，這類人群指氧要求維持在92-94%即可。因此，對于居家觀察的新冠感染患者，判斷自己是否有“白肺”可能的一個辦法是，看是否有明顯胸悶、憋氣的癥狀，然后多時間段長程測量指氧水平，無肺疾病人群多數(shù)時間指氧維持在＞94%，一般無需擔心，即便肺內有病變通常不嚴重，可繼續(xù)居家觀察對癥治療。如大部分時間指氧≤94%，則需警惕已出現(xiàn)“白肺”，需至醫(yī)院就診進一步完善胸部CT明確肺內病變情況。對于平素就有低氧的患者，此時測量指氧要與平素指氧進行對比，不低于平素指氧一般“白肺”可能性小，如明顯低于平素水平，應盡快到醫(yī)院就診檢查。-----------------------------------看病小貼士任何疾病，了解平素基礎水平非常重要，建議平時在家做好記錄，至醫(yī)院就診時向醫(yī)生提供基礎血壓、心率、指氧、心電圖等數(shù)據(jù)，對于疾病評估非常有幫助-----------------------------------2023年01月08日975
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